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STR检测

短串联重复(Short tandem repeats, STR)，又称微wei星DNA(Microsatellite DNA)或简单重复序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR)，是广泛存在于原核生物和真核生物***组中的核苷酸重复序列。有丝分裂过程中DNA链之间的错配引起的fu制滑动被认为是导致STR产生的较为常见原因，并且依据不同fu制单元大小的不同以及不同物种之间，fu制滑动发生的概率也不相同。miRNA测序microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。

STR是以核心序列 (core repeat units) 首尾相连多次重复形成。每个STR的核心序列结构相同，长度为2-6bp，但其重复单位数目和重复区域的长度不同，因此STR在不同种族、不同人群之间的分布具有差异性，构成了STR遗传多态性。不同个体之间在一个同源STR位点的重复次数也不同，因而同***识别一样，STR位点分析也可对个体进行身份识别。通过识别个体***组在特***点的特定序列重复，即可创建其***档案。2、细胞转染:取两个EP管，一个加入Opti-MEM、核心质粒和包装质粒。基于此，STR分析法已经成为一种重要的鉴定分析方法，应用于法***、qin子鉴定及细胞鉴定等领域。

3、参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

4、其它说明

阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。

15.测序发现引物有突变是怎么回事？

答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。核酸合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法解决这个问题。这些方法究竟孰优孰劣，斯坦福大学***院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不造成的，Caping反应主要是封闭数5′-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚转化到大肠中，可能被***中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 （脱呤），2,6 diaminopurine , DNA和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。脱呤现象在富含呤的引物中发生的频率较高。用预先固化在beads上的蛋白质A的抗ti免yi沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来，再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。脱呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。

引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。

25.PCR扩增不出就引物有问题吗？

答：基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的***片段。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充分混匀。

引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：

（1） RT-PCR。请注意，很多***通过常规RT -PCR方法是很难扩增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标***在特定***和细胞中含量。

（2）从***组中扩增。一般情况下，***在***组中都是单拷贝，***组作为模板需要严格控制用量。***组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH