盐城细胞增殖实验高通量测序检测「英瀚斯」

细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡

流式细胞术检测细胞周期：

细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿liu球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿liu***中相应的病理生理特征。

PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。调亡I期(pro-apoptosisnuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象(c***itati)的空泡结构。

一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。

细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。

一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。

结果示例：

                                   图 A 细胞周期检测图；B 细胞凋亡检测图

血管生成技术

一、服务介绍

zhong瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。由于zhong瘤***这种新生血管结构及功能异常，且血管基质不完善，这种微血管容易发生渗漏，因此肿liu细胞不需经过复杂的侵袭过程而直接穿透到血管内进入血流并在远隔部位形成转移。消化传代后细胞呈短梭形或三角形,单层生长,铺路石状,Ⅷ因子表达阳性,呈指数增殖。

血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao细血管和毛xi血管后微静脉新的mao细血管性血管的生长。无论原发性zhong瘤还是继发性zhong瘤，一旦生长直径超过1~2 mm，都会有血管生成。这是由于zhongt瘤细胞自身可分泌多种生长因子，诱导血管生成。2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

流式细胞分选

流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的--种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单ke隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离,单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞***、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2。

细胞培养中常见的污染及解决方法

霉菌污染

正常情况下，培养基在 37℃ 培养箱中培养两三天，在倒置显微镜下仍保持透明，无杂质。一旦出现絮状杂质，显微镜下可见丝状和团块状漂浮物，菌丝明显。此时，虽然细胞仍在生长，但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。

解决方法：用***铜溶液擦拭 CO2 培养箱，向托盘中加入饱和***铜或消毒后加入饱和磷酸氢二钠高盐溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暂时转移所有细胞，并立即使用 guo 氧擦拭培养箱，包括层板和内壁。将 guo 氧放在培养箱中一小时，使蒸汽扩散，待 guo 氧气味消散后，将细胞转移到培养箱中。值得注意的是，培养箱需要每两个月定期清洗一次，尤其是在梅雨季节。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精连续擦拭培养箱，用紫外线照射也是一种有效的方法。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性***，特别是、***退行性***及***纤维化的发病密切相关，目前对于自噬液的检别是自噬与其相关***研究领域的热点。

为防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、***素、fang

线菌素 D 或青链。一旦被污染，就不可能***，即使使用上述，也没有什么区别。对于支原体污染的细胞培养，选择是丢弃污染的培养物，并用使用新鲜的无支原体的储存液，消毒环境。如果所有的细胞都被污染了，那可能是整个培养系统污染了。因此，必须对培养基和实验设备进行检查。如果只是个别污染，可能是操作问题，有必要注意实验操作步骤的规范。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。