渭南细胞生物学实验DNA水平 南京英瀚斯

 细胞ELISPOT检测    

     1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用PBS洗涤3次，每次3min；

     2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有Hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；因***细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广掺入双链DNA内的Brdu,以氢链与腺呤结合，不能直接与抗Brdu反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％CO2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     6．加入辣根过氧化物酶结合的亲合素（***i-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。

细胞检测服务

作为生物体结构和功能的基本单位，细胞在机体的各项新陈代谢的生命活动中发挥着重要的作用，与此同时，细胞的生理过程，在一定程度上也是机体生命活动的反应。因此利用多种精密仪器，结合特异性的检测***，对体外培养的细胞直接检测其增殖的基本过程，或对细胞进行不同的处理后检测细胞生活周期内各项指标的变化，从而深入揭示细胞新陈代谢的具体机制。细胞筛选好后，使用定量PCR和Westernblot检测目的***的稳定表达情况。

平板克l隆形成实验基本步骤::

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200 个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37团5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10~30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的数。后计算形成率。形成率= (数/接种细胞数) x100%平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。(5)2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状)，PBS洗三次。细胞- -定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

细胞培养中常见的污染及解决方法

黑点污染

黑色的游动点能穿透滤膜并在空气中扩散。它们在低倍镜下显示为黑色圆点，在高倍镜下显示为可移动的黑点。培养液也不浑浊，一般影响较小，因此细胞仍可使用。通常，黑点污染后，细胞生长良好，运动物体无明显增加，培养基的颜色和透明度无明显变化。在同一批培养的细胞中也可以发现类似的现象。因此利用多种精密仪器，结合特异性的检测***，对体外培养的细胞直接检测其增殖的基本过程，或对细胞进行不同的处理后检测细胞生活周期内各项指标的变化，从而深入揭示细胞新陈代谢的具体机制。

解决方法：黑点对细胞生长状态没有明显影响，细胞增殖后会自然消失，因此除了置换外，无需特殊处理。如果细胞可能被小的运动点污染，建议增加培养皿细胞密度，以提高细胞存活率。