渭南pcr实验室消化系统模型 英瀚斯生物科技公司

单核苷酸多态性( SNP )实验

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即单核苷酸多态性 ,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphi***)。据估计,在人类***组中,大约每千个碱基中有一个SNP ,无论是比较于度多态性(RFLP)分析还是微标记(STR) ,都要广泛得多。用新一代高通量测序技术对某物种的特定***或细胞进行转录组测序，与参考***组比较，可以得到***表达差异、可变剪接、融合***等遗传调控信息。

实验方法原理:

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即单核苷酸多态性,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphi***)。据估计,在人类***组中,大约每千个碱基中有一个SNP ,无论是比较于限制性段长度多态性(RFLP)分析还是微标记(STR) ,都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的单位,据估计,人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。-般认为,相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。结果示例：细胞荧光染通过观察细胞中蛋白的荧光强度和***分析该蛋白的表达变化。 于是,我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型( haplotype b大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型(每个具有至少5%的频率),它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。-个染色体区域可以有很多SNP位点,但是我们一-旦掌握了这个区域的单体型,就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行***分型,获取大部分的遗传多态模式。

二、大肠菌群检验方法:

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的***，即:需氧及兼性厌氧、在37°C能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有和原***商检局制订的行业标准。***腺病毒已知有33种，分别命名为ad1-ad33，研究详细得是ad2。两个标准方法在检测程序上略有不同。

(一):采用三步法，即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36士1C培养48土2h，观察是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°C培养18-24h，观察菌落形态。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。证实试验:挑取平板上的菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36士1°C培养24土2h,观察产气情况。

报告:

根据证实为大肠阳性的管数，查MPN表，报告每100ml ( g)大肠菌群的MPN值。具体操作参见GB4789. 3-94 《中华人民共和***品卫生微生物学检验大肠菌群测定》

(二)原***商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠进行检测。本方法采用两步法：推测试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36士1C培养48士2h，观察是否产气。证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，36士1°C培养48士2h，观察是否产气。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了***allRNA的信息，所以需要另外再构建一个***allRNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他***allRNA的鉴定及注释信息。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。具体操作参见SN0169-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠检验方法》

  全转录组测序    

全转录组是指特定***或细胞在特定状态下所有转录产物的总和，包括mRNA和各种noncoding RNA。我们知道生物体本身的转录过程是一个动态变化且十分复杂的分子作用网络，如果只是对某个单一RNA分子的研究，有时并不能准确的发现分子作用机制。而竞争性内源RNA(ceRNA)理论阐述了一种全新的转录调控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假***等）分子能够通过miRNA应答元件（microRNA Respe Element, MRE）竞争性地结合相同的miRNA来调节彼此的表达水平。随着对lncRNA在哺乳动物进化及人类***发生和发展中作用的日益关注，lncRNA调控机制已成为当前遗传学研究的热点问题。举个例子：miRNA会导致***沉默现象发生，而如果lncRNA竞争性结合了miRNA，从而影响了miRNA***沉默功能实现。

      ceRNA是目前转录调控领域的热点内容之一，通过全转录组研究能够系统性的阐述ceRNA的分子作用机制。目前对全转录组简便的方法就是构建2个测序文库分别进行测序。标准的生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究内容，靶向调控网络、ceRNA网络、共表达网络分析可以将这几种RNA联合起来分析，从而发现新的调控网络模型。往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s，冰上静置12min[问l。去除rRNA的链特异性文库，含有的RNA信息含量十分丰富，通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了***all RNA的信息，所以需要另外再构建一个***all RNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他***all RNA的鉴定及注释信息。全转录组测序方案路线图如下所示：

染色质免l疫共沉淀技术(ChIP)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l细胞或者***的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与***表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。双向电泳分离待测样品(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。采用结合微阵列技术在染色体***表达调控区域检查染色体活性,是深入分析***l症、心血l管病以及******系统紊乱等***主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内，当F与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNAl片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。所有样品4C离心，转速:13500转1分钟，时间:15min。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。