南通pcr引物设计常规及特殊染色 南京英瀚斯生物科技

RNA提取

1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。

2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。

5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。

6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。

7. 所有样品4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.

8. 再次标记一批同样编号EP管。

9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充

分混匀。4C冰箱35min。

10. 4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.

11.弃去.上清液，加1m175%乙醇，轻摇7]。

12. 4C离心，10600转/分钟，时间: 5min.

13. 弃上清液滤纸吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。

***RNA提取

1、剪米粒大小***块放入EP管中标号。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到***为宜。

4、加700u1 trizol静 置5分钟。

***组甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色谱(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -种比较传统的方法,是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增l高。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。故而能够定量测定***组整体水平DNA甲l基化水平。该方法由Ruo等1980年首l次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢l氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mC/(5mC+5C)的积分面积就得到***组整体的甲l基化水平。这是一种检测DNA甲l基化水平的标准方法。

2.高l效毛细管电泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)这是一-种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。银染法对凝胶进行染色(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗3。用HIPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏***高。

分子生物学检测服务

随着生命科学和化学的不断发展，人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从单个的生物体到qi官到***到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构（如核酸序列），来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理（病理）状态的差异。这就为生物学和***的各个领域提供了技术平台。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°C培养18-24h，观察菌落形态。分子生物学检测技术是现代分子生物学与分子遗传学取得进步的结晶，是在人们对***的结构以及***的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学检测技术的方法学研究取得了进展，先后建立了各种分子生物学检测技术。

3、参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

4、其它说明

阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。98C变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96C10s，50C5s，60°***min，25个循环，扩增结束后设置4C保温。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。