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透射电镜自噬小体检测

胰酶消化，收集作用后的细胞，离心，先将细胞块固定在2.5%成二醛和0.1%的PBS溶液中保存在4C中过夜。

再用乙醇梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。随后超薄切片用铜网固定，后用***醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。通过TEM分析凋亡细胞内超微结构变化，拍照保存。

贴壁细胞:先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化或者用细胞刮(会产生碎屑)刮下:带培养液进行离心，100-1500/mim 5 10min。离心完毕倒出培养液。管底的细胞团不要打散， 沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定约1h-2h. 也可在4C冰箱过夜。形成率=(数/接种细胞数)x100%平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

流式细胞分选

流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的--种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单ke隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离,单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞***、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。细胞培养：然后在无菌恒温细胞培养箱内培养接种好的96孔细胞培养板，并实时观察细胞状态。

细胞培养中常见的污染及解决方法

支原体污染

支原体是隐蔽的污染物，不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象，比如细胞病变和浊度或 pH 值变化（即使在严重污染的培养基中），这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛中，支原体是常见的微生物之一。

解决方法：通常的过滤灭菌方法对支原体没有影响。细胞一旦被支原体污染，特别是对重要的细胞系，必须去除支原体，一般的方法有、抗和抗与补体联合。值得注意的是，支原体很突出的结构特征是没有细胞壁。因此，它对作用于细胞壁的生物合成（如 β-内酰胺类、万古等）完全不敏感，并且通常对多粘菌素、利福平和类具有耐药性。相反，四环素类和大环内酯类对支原体的***作用很强，而氨基糖苷类和氯的***作用较弱。血管生成技术一、服务介绍zhong瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。