细胞系胃***模型「英瀚斯」

细胞增殖检测

     本公司应用MTT比色法， 检测细胞存活和生长。细胞筛选好后，使用定量PCR和Westernblot检测目的***的稳定表达情况。其检测原理为huo细胞内线粒体中的琥珀酸脱氢酶能催化外源性无色的MTT形成蓝色的结晶Formazan，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二jia基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的Formazan，用酶联mian疫检测仪在一定波长处测定其光吸收值，可间接反映huo细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

     该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿liu药wu筛选、细胞毒性试验、以及肿liu放she敏***测定等。一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。服务内容      1. 细胞接种：收到客户细胞后，我们会用细胞计数板计数细胞，得出细胞悬液浓度。计算出应稀释的倍数，按MTT***盒要求在96孔板内接种 相应浓度的细胞悬液；

     2. 细胞培养：然后在无菌恒温细胞培养箱内培养接种好的96孔细胞培养板，并实时观察细胞状态；  

     3. yao物处理并呈色：按不同浓度梯度加入yao物作用细胞；

     4. 溶解，比色：加入MTT检测***，按操作要求孵育相应时间，在mei标仪内检测对照组和实验组的吸光值。并处理数据得出比色结果。

骨sui内皮祖细胞的分离培养

方法:使用密度梯度离

心法汲差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化，使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133 表达情况.结果与结论:培养前4 d细胞增殖不明显第5~10天迅速增殖，并可见细胞集落及线状结构形成培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能流式细胞仪检测体外培养第十天的细胞,CD133+细胞占19.2%,CD34+细胞占28.7%,CD34+ /CD133+细胞占19.1%.说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨sui内皮祖细胞.

软gu细胞培养

(1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节(保留周围肌肉，软gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软***，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软gu***，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软gu***被风干。5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min。

(3)PBS缓冲液充分漂洗软gu小块3次，然后用小剪刀将软gu块切碎至约Imm3大小。

(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0.2%的II型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37°C恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min,收集细胞(沉淀物),加入含10%的胎牛xue清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软gu细胞混悬液。目前，已报道的自ES细胞诱导分化的细胞主要包括胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、***细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软gu细胞和黑素细胞等。

(5)把消化所得的软gu细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数,并把细胞混悬液密度调整为2x105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37°C、5%CO2。

(6)未消化完的软gu小块继续用II型胶原酶如_上法消化，直至软gu块基本消失。

(7)每日在倒置显微镜下观察软gu细胞生长情况并拍照保存。

平板克l隆形成实验基本步骤::

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200 个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37团5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10~30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的数。25%胰酶消化，1:2传代，其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。后计算形成率。形成率= (数/接种细胞数) x100%平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞- -定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。