单细胞测序服务介绍「英瀚斯」

细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系

慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化***盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。干细bao培养诱导分化干细bao是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞，理论上具有无限分裂能力，在特定条件下，可分化成特定***。

滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别293T细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。

细胞：在病毒前一天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行，病毒数量根据推荐细胞的MOI加入（若无推荐MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量PCR和Western blot检测目的***的稳定表达情况。2作为标志分子,percoll离心后细胞悬液经FACS分选后获得细胞纯度。

实验流程：慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 A 病毒滴度检测；B 目的细胞病毒效果图

细胞培养中常见的污染及解决方法

***污染

***污染后，培养基一般清澈，保持原色。细丝可以在显微镜下观察到。，一些***类似于死细胞碎片，但其中许多清晰可见，看起来像珊瑚，比较容易区分。此外，它们会慢慢长出细细的黑色细丝，因为它们生长得比较慢，不像***那样容易被发现，一旦发现培养基被污染，它们将很难存活。滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别293T细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。

解决方法：一旦被***污染，果断丢弃，然后对细胞房、CO2 培养箱、器皿和培养基进行消毒。

选择实验外包公司需要注意哪些事项？

1. 实地考察

可以到公司实地考察一下实验室，看一下实验室环境、设备仪器情况，是否能满足实验方案所需条件。能整体承接课题，动物细胞。一些大型仪器公司不一定有，看有没有高校平台资源渠道共享。确保是真实进行实验的，这样后续实验结果数据也比较可靠。

2. 方案评估

实验合作前期一般会进行所需实验内容的评估，来确定终实际实验方案和报价。方案评估可以看出外包团队的性。一个可靠的外包公司会对方案提出针对性的建议，评估各项实验是否能做，以及根据预算情况和实际操作对细节适当地调整。任何实验都是有不确定性的，但是前期敲定好方案能为后续实际开展实验打下良好基础，也会省去许多隐患和麻烦。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10~30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。