绵阳PCR实验室询问报价「英瀚斯」

动物***细胞***组DNA提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物***块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见***块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

  全转录组测序    

全转录组是指特定***或细胞在特定状态下所有转录产物的总和，包括mRNA和各种noncoding RNA。我们知道生物体本身的转录过程是一个动态变化且十分复杂的分子作用网络，如果只是对某个单一RNA分子的研究，有时并不能准确的发现分子作用机制。将含有靶***mRNA同源互补序列的RNA（DoublestrandRNA，dsRNA）导入细胞后，能够特异地识别该mRNA，引起mRNA的降解，从而导致相应的功能缺失。而竞争性内源RNA(ceRNA)理论阐述了一种全新的转录调控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假***等）分子能够通过miRNA应答元件（microRNA Respe Element, MRE）竞争性地结合相同的miRNA来调节彼此的表达水平。举个例子：miRNA会导致***沉默现象发生，而如果lncRNA竞争性结合了miRNA，从而影响了miRNA***沉默功能实现。

      ceRNA是目前转录调控领域的热点内容之一，通过全转录组研究能够系统性的阐述ceRNA的分子作用机制。目前对全转录组简便的方法就是构建2个测序文库分别进行测序。目前常用的RNA干扰手段为miRNA、shRNA和siRNA等。标准的生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究内容，靶向调控网络、ceRNA网络、共表达网络分析可以将这几种RNA联合起来分析，从而发现新的调控网络模型。去除rRNA的链特异性文库，含有的RNA信息含量十分丰富，通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了***all RNA的信息，所以需要另外再构建一个***all RNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他***all RNA的鉴定及注释信息。全转录组测序方案路线图如下所示：

凝胶阻滞迁移电泳检测服务（EMSA）

凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一种研究DNA/RNA结合蛋白和其相关的DNA/RNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗ti等参照物，基于DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合体在聚bing烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理，当转录因子与特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。

单细胞RNA测序

单细胞RNA测序也称scRNA-Seq。通常而言，一般的***细胞RNA-seq实验会产生1000万个读数，如果一个***的频率超过50RPKM，即每百万读数中每千个碱基中超过50个，这一***即被认为有表达。腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml,可以满足各类整体实验的使用要求。泊松分布下，1kb长的***有超过500个读数和4%的小变异系数，即CV值；哺乳动物细胞通产含有200,000个mRNA，因此至少要用50个单细胞一起才能到达小CV值；考虑到逆转录的效率和环境干扰等因素，为得到准确的表达和细胞种类的识别，需要使用的细胞数量实际要更多。