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染色质免l疫共沉淀技术(ChIP)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l细胞或者***的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与***表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。采用结合微阵列技术在染色体***表达调控区域检查染色体活性,是深入分析***l症、心血l管病以及******系统紊乱等***主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内，当F与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNAl片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。

通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：按照1：1000用无培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。目前主要使用Sybrgreen和taqman法对RNA含量进行检测。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

2.、检测

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光或流式细胞仪检测。

对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。

9.如何计算引物的Tm值？

答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：

Tm =            4℃   (G + C)+ 2℃   (A + T)

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size

公式中，Size = 引物长度。

Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrati f***or hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cati stabilize the DNA duplexes.

22.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？

答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。富衡生物为用户提供高通量的lncRNA芯片进行lncRNA表达谱分析，该芯片基于Agilent的SurePrint技术生产，实验稳定可靠。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

23.引物不纯会有什么后果？

答：引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

24.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

答：如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mMT ris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。CmRNA相对表达量变化从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。