pcr实验室择优推荐「多图」

分子实验介绍——印迹（Western blot）检测

通过SDS-PAGE凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的起反应，再与酶或同位素标记的第二起反应（目前主要用HRP标记的第二），经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特异性目的***表达的蛋白成分（目前主要使用鲁米诺和二抗中的HRP反应发出荧光，通过仪器或者胶片显色）。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。转录组测序转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。

实验流程：细胞收集-细胞裂解，蛋白提取-蛋白变性-SDS-PAGE电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照

结果示例：

图 A不同大小的质粒转染细胞后，Western blot检测图片；B A蛋白不同培养时间后Western blot检测图片；C 使用Image pro plus软件对A蛋白灰度检测，A蛋白表达变化统计图

腺相关病毒包装原理

腺相关病毒( adeno-associated virus, A***)是一类细小病毒, 基铟组为单链DNA ,对分裂细胞和非分裂细胞均具有gan染能力。通常需要腺病毒或疱zhen病毒帮助其在体内fu制扩增。重组腺相关病毒( recombinant A***, rA*** )是利用A***2型***组与不同xue清型的衣壳蛋白***组结合产生的混合体病毒载体,可将目的***的CDS区序列或者RNAi干扰序列插入rA***表达质粒中,包装病毒后gan染细胞完成对目的***的操作。腺相关病毒具有gan染温和,免yi原性小,长效稳定表达的特点,主要应用于动物体内***。源井生物提供的腺相关病毒颗粒经过超su离心纯化,并通过qPCR对病毒***拷贝进行滴定。腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml ,可以满足各类整体实验的使用要求。用亚***氢盐处理***组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变。

注意事项

1. 为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。

2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。

3. 为了避免蛋白质的氧化，将 0.1～1 mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或 β-巯）加入到缓冲溶液中。

4. 为了避免***对目标蛋白的***，将 1～10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。

5. 为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。

6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。

7. 蛋白浓度不要太稀。

8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。

9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解，避免 DNA 对蛋白的污染。

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，而Bioneer自行研制的384并行高通量DNA合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，***消耗量的不同和单个循环用时的多少。基于第二代测序技术的miRNA测序，可以一次获得数百万条miRNA序列，能够快速鉴定出不同***、不同发育阶段、不同***状态下已知和未知的miRNA及其表达差异，为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

亚磷酰胺三酯法合成DNA，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC,和PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。