细胞实验细胞分离培养「英瀚斯」

大鼠shen小球内皮细胞分离培养

2.原代细胞培养:(1)shen脏原位灌洗:SD大鼠用25%乌拉坦腹整***麻***后仰卧固定。细胞实验部分设备图片公司目前拥有多项专利产品及技术，其中发明专利两项，软件著作权八项，实用新型专利三项，商标两件。胸腹部消森并分离胸主动脉,以无菌的冷Hank液漱朱洗血.同时剪破shen静脉利于液体流出。1-2min后shen脏色泽变白,取出双shen冰浴保存。

(2)shen小球分离:参照Green等方法改进。将灌洗后的shen脏撕下shen被膜.去除髓质后将皮质剪成约1-2mm'的碎块，轻碾shen皮质依次通过80.120和200目钢筛。收集shen小球。

(3)shen小球消化和培养；将提取的shen小球加人0.1% IN 型胶原酶消化后收集沉淀。25%胰酶1mMEDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清终止消化,用一次40-um孔径的滤器过虑制成单细胞悬液,30%percoll不连续密度梯度法离心富集精原gan细胞,再根椐未分化精原gan细胞表面thy1。以2x10* 的shen小球数接种于铺有1%明胶培养瓶内,加A配制好的内皮细胞培养液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰岛素/ml.血管内皮生长因子20 ng /ml、肝素钠100 u/ml.青莓su100 U/ml、链霉su100 μ/ml) .静止培养3 d后逐日观察shen小球的贴壁情况。待shen小球充分贴壁后常规换液.第3同进行纯化。

成纤维细胞分离方法

1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外- -组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出，后用第三组剪刀和镊子将小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS,再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另- -装有D-PBS的平皿中，并用***刀片将其细细切碎。小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立细胞之间的相互调控作用奠定基础。

3. 用200 μ的移液反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4C 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37C水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4.将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

5.细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(- -般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。

6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。

7. 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8.细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者- -般不超过五分钟)，按1:5传代。

9. 细胞再次长到覆盖率80-90%左右， 将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。

关于细胞培养的常见问题:

Q: 细胞在培养过程中出现碎片如何处理？

A: 贴壁细胞在移除原培养液后，用 PBS 冲洗 2-3 遍；悬浮细胞离心移除原培养液后，加入 PBS 重悬，离心移除 PBS; 一般建议重复上述步骤 2-3 遍，用 800-1000rpm 离心 3-5 分钟。

Q：细胞冻存能放在 -80℃ 保存吗？

A：长期保存的细胞应当放在液氮（-196℃）中保存，短时间（一般 1 周-2 周）可以存放在 -80℃。

Q：培养瓶是用密封盖好，还是用透气盖好？

A：都可以。只是在使用密封盖培养瓶时，瓶盖旋至约 2/3，不要完全拧紧，预留约 1/3 以便细胞可以透气；有些品牌的密封盖培养瓶的瓶盖上有适合位置指示标志。

Q:何谓 FBS,FCS,CS,HS?

A: Fetal bovine serum(FBS)和 Fetal Calf Serum(FCS)之间没有区别，都是指胎牛；FCS 不是正规命名，尽量不使用。Calf Serum（CS）则是指小牛。Horse Serum(HS)则是指马。

Q:中可能出现的沉淀物是什么？

A:基于多年的实验研究，用于细胞培养的胎牛以及其它中可能会存在以下种类的沉淀物：

（1）纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到 1-2mm，可以用肉眼观察到。电镜形态学观察法是一种比较经典、可靠的方法，被认为是确定细胞凋亡的金标准。因为都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（可溶性的形成絮状纤维蛋白的前体）在处理过程中仍然处于溶解状态，当经过的过滤分装后，就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。

（2）磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使出现浑浊，并且在 37℃ 培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点， 这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。

（3）胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。他们也是中出现沉淀物的常见原因。