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分子实验介绍——印迹（Western blot）检测

通过SDS-PAGE凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。2、DNA变性时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的起反应，再与酶或同位素标记的第二起反应（目前主要用HRP标记的第二），经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特异性目的***表达的蛋白成分（目前主要使用鲁米诺和二抗中的HRP反应发出荧光，通过仪器或者胶片显色）。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验流程：细胞收集-细胞裂解，蛋白提取-蛋白变性-SDS-PAGE电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照

结果示例：

图 A不同大小的质粒转染细胞后，Western blot检测图片；B A蛋白不同培养时间后Western blot检测图片；C 使用Image pro plus软件对A蛋白灰度检测，A蛋白表达变化统计图

聚合酶链式反应(PCR)

操作步骤

1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

加ddH2O至

μl 50

视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C

预变性3-5min ,进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ,循环30-35

次，后在72°C保温7min。

3.结束反应, PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。

4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以

除去石蜡油;否则,直接取5- 10μl电泳检测。

单细胞测序（英语：Single cell sequencing）采取优化的下一代DNA测序技术（NGS）检测单细胞的序列，可以获得特定微环境下的细胞序列差异以方便研究其功能差异等。对个体细胞的DNA测序可以帮助我们了解例如在中的小范围细胞的变异；对其进行RNA测序可以帮助我们了解和鉴别不同的细胞类型与其表现的***，对研究发育生物学等有较大裨益。此外，Illumina还捕获了未翻译的区域，这是NimbleGen和安捷伦平台无法靶定的。

分离单细胞

在全***组扩增和测序前，有很多方法可以分离细胞个体，其中流式细胞术（FACS）较为常用。个体细胞可以用显微操作来收集，这样较为快捷而且成本较低，但是比较有技术难度，而且显微镜下对细胞的错误分类容易影响实验结果。激光捕获显微切割技术（LCM）亦可以用来收集单细胞。细胞内，当F与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。但是尽管激光捕获显微切割可以保留样本细胞在***中的空间位置，但是捕获单细胞的时候容易连带周围细胞的物质。高通量的细胞个体分离还可以使用微流控技术。微流控技术和流式细胞技术都能准确而自动地分离无偏样本。但是，两种方法都要求首先将细胞从其为环境中脱离，因此可能在RNA表达分析中造成对转录数据的干扰。