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RNA提取及注意事项

研究***的表达和调控时，需要从***或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低经常影响RT-PCR、cDNA库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

主要***

Trizol是一种新型总RNA抽提***，内含异***胍等物质，能迅速破碎细胞，***细胞释放出的核酸酶。

1.

Trizol***含有，具***性和刺激性，注重操作。

2.

RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。

3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔***和骨除外）。在清洗和裂解细胞时在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些***由于细胞壁的特别结构，可以加入Trizol***同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，而Bioneer自行研制的384并行高通量DNA合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，***消耗量的不同和单个循环用时的多少。CmRNA相对表达量变化从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。

亚磷酰胺三酯法合成DNA，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC,和PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？

◆　脱盐

寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构，首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离，2-乙氧基--磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的DNA结构。然而，必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。microRNA芯片:RNA干扰(RNAInterference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转***或外来病毒qin犯的防御机制。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ＰＣＲ检测等基础生物研究。

◆　BioRP / OPC纯化

如果寡核苷酸以“三苯”的形式合成，则N-寡核苷酸包含5’-DMT基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为DMT基有强的亲脂的特性，有5’-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－DMT寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团，所以，我们能够成功的把想要的N-寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。