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分子实验介绍——荧光检测

细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原***的技术。在细胞中，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达***。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白***和表达的实验方法。

实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-DAPI染色-荧光显微镜拍照或激光共聚焦显微镜拍照。

结果示例：

细胞荧光染

通过观察细胞中蛋白的荧光强度和***分析该蛋白的表达变化。

活性氧检测***盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的***盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。MiRNA是一类可以通过RNAi机制调节***表达的内源性小RNA，人工miRNA与shRNA的设计原理基本相同，由于miRNA具有内源性，因此其更易产生有效的***沉默。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本***盒提供了活性氧阳性对照***Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。

一、注意事项

1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

18.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见***块，转入1。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5'端避免使用G。

◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在 68-70C   左右。

有用的荧光染料参数