内江pcr引物设计承诺守信「英瀚斯」

转录组测序

转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与***组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。lncRNA和mRNA同时检测：芯片上包含有的lncRNA和新的mRNA序列检测探针。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其***表达情况是不相同的。转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，快速地获取某一物种特定qi官或***在某一状态下的转录本。相对于传统芯片而言，RNA-Seq无需预先设计探针，即可对物种的细胞类型的转录组进行检测，能够提供较的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的良好工具。

外显子测序

外显子组测序（exome-seq）是对定向富集的***组DNA进行高通量测序，它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。2009年，外显子组捕获工具的出现，让外显子组测序这种技术迅速红起来。到目前为止，已有超过1万个外显子组被测序。

如今有多家公司推出了外显子组捕获***，包括罗氏NimbleGen、安捷伦、Illumina，还有现在的华大***。这些方法究竟孰优孰劣，斯坦福大学***院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。该研究结果发表在《Nature Biotechnology》上。但是长期以来，大规模的蛋白质表达分析谱并没有提升我们对生物标志物的认识，其主要原因是差异蛋白的分析结果缺乏规模化的验证。研究人员利用安捷伦、Illumina和NimbleGen的外显子组测序平台对同一个人类血液样品进行分析。他们的结 果表明，NimbleGen平台作为一个使用高密度重叠探针的平台，尽管覆盖了较少的***组区域，但在灵敏检测小的变异时所需的测序量也少。在同样获得80M测序数据的情况下，NimbleGen有97%的目标序列达到10x以上的测序深度，而其他产品只有90%。而安捷伦和Illumina的探针能够在低密度下捕获更多数量的变异。此外，Illumina还捕获了未翻译的区域，这是NimbleGen和安捷伦平台无法靶定的。研究人员还比较了同一样品的外显子组测序和全***组测序（WGS），显示外显子组测序能够检测到WGS错过的小变异。

除了文中提到了三个主流平台，外显子组捕获方面的新产品也在不断推出，研究人员的选择也将更广泛。腺相关病毒具有gan染温和,免yi原性小,长效稳定表达的特点,主要应用于动物体内***。罗氏NimbleGen即将推出新一代的外显子液相捕获产品。这一新产品将可捕获64M的***组序列，包括外显子以及miRNA，它含与其他NimbleGen液相捕获产品相同的2.1M高密度探针，以高xiao、均一、特异、的定向捕获。

分子与质粒载体构建

实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。高l效毛细管电泳法(High-performanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)这是一-种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

◆　HPLC

如果合成的寡核苷酸应用于，定向诱变或定量的***探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则HPLC纯化被广泛地用于这个目的。目前的研究已证实，lncRNA参与X染色体沉默，***组印记以及染色质修饰，转录ji活，转录干扰，核内运输等多种重要调控过程。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于35-mer)。

◆　PAGE

对于长的寡核苷酸的纯化（50-100mer），我们推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质。如今有多家公司推出了外显子组捕获***，包括罗氏NimbleGen、安捷伦、Illumina，还有现在的华大***。尽管PAGE显示出高的纯化效率（＞98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。