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脂质体瞬时转染

1、细胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。

2、转染前换上没有抗sheng素的DMEM+胎清(10%)。

3、将质粒DNA (约2-4ul) 2ul 加入dorf管中+DMEM至50u1。

4、脂质体5ul补培养基至50ul混匀静止5分钟(质粒与脂质体比例为1:2或1.5:2.5)。

5、将含有脂质体的培养基与含质粒的混合总体积100ul室温放置30分钟。

6、吸取混合物均匀加入每一个孔中。

7、将6孔板放入培养箱中继续培养6小时后吸出培养基换上新配置的培养基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。

8、培养24小时。

细胞培养中常见的污染及解决方法

原生动物污染

原生动物污染后，细胞培养基变得轻微浑浊。在显微镜下，大量的小点来回移动。虽然此时细胞仍能生长，但繁殖速度减慢，细胞生长状态不好，边缘不清，变得不透明。细胞筛选好后，使用定量PCR和Westernblot检测目的***的稳定表达情况。原生动物与细胞形成共生关系。同时，原生动物与细胞竞争营养。这种共生现象非常普遍，但以细胞为主，因为原生动物的数量相对较少，因而对细胞的正常生长没有影响，只有当它们达到一定数量时，才终爆发成为循环。

解决方法：原生动物污染的原因有很多，如液体消毒问题、操作问题、环境问题等，如果细胞足够，果断丢弃被污染的细胞和复苏细胞。如果要保留，需要购买使用相关的灭菌***。

选择实验外包公司需要注意哪些事项？

1. 实地考察

可以到公司实地考察一下实验室，看一下实验室环境、设备仪器情况，是否能满足实验方案所需条件。能整体承接课题，动物细胞。一些大型仪器公司不一定有，看有没有高校平台资源渠道共享。确保是真实进行实验的，这样后续实验结果数据也比较可靠。

2. 方案评估

实验合作前期一般会进行所需实验内容的评估，来确定终实际实验方案和报价。方案评估可以看出外包团队的性。小鼠精原gan细胞分离富集和培养成年小鼠gao丸中约有108个细胞,其中约有2×104个是精原gan细胞,仅占gao丸生精上皮细胞总数的0。一个可靠的外包公司会对方案提出针对性的建议，评估各项实验是否能做，以及根据预算情况和实际操作对细节适当地调整。任何实验都是有不确定性的，但是前期敲定好方案能为后续实际开展实验打下良好基础，也会省去许多隐患和麻烦。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 细胞/孔接种 6 孔板 (或 35 mm 培养皿) 培养 24 小时，使其达到 50～60% 板底面积。

(2) 在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下：

①在 1 mL 无 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。

②旋转 1 秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

③室温下放置 5～10 分钟，使 DNA 结合在脂质体上。

(3) 弃去细胞中的旧液，用 1 mL 无 DMEM 洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂质体复合物，37℃ 培养 3～5 小时。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，继续培养 14～24 小时，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM，2 mL/孔，再培养 24～48 小时。

(6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下：

(1) 接种细胞同前，细胞长至 50% 板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2)、(3) 步骤。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM，37℃ 培养 48 小时。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染，方法参照细胞筛选法进行。