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细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系

慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化***盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。细胞沉淀用15mlMEF生长培养基重悬后进行细胞计数(--般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。

滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别293T细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。

细胞：在病毒前一天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行，病毒数量根据推荐细胞的MOI加入（若无推荐MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量PCR和Western blot检测目的***的稳定表达情况。2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

实验流程：慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 A 病毒滴度检测；B 目的细胞病毒效果图

细胞培养中常见的生物污染包括***污染、霉菌污染、支原体污染、黑点污染、***污染和原生动物污染。这些污染在细胞培养中的特点及相应的解决办法如下：

1.***污染

***在普通倒置显微镜下呈黑色和细砂状。根据gan染菌的种类不同，可能会呈现不同的形状，培养液一般会变得浑浊、***，对细胞生长有明显影响。

解决方法：仔细检查器具的灭菌情况，确保通风时间和高压灭菌器的压力是否足够。重要的是，与培养基接触的移液管等物品如果被污染两次，则可能会导致储存溶液也受到污染。所以一定要注意！S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。下次使用前要检查培养基的浑浊度。此外，建议在培养基中添加抗生su。

选择实验外包公司需要注意哪些事项？

报价

报价单一定要有明细。规范的外包公司会根据实验方案里的各项内容进行核算报价，材料是多少、人工检测是多少，可以看到每一笔钱花在哪里，避免笼统的报价。另外注意不要一味地追求，做过实验的都知道实验成本，外包还需要考虑人工成本。如果价格过低，实验数据就难以保证可靠和来源了。当然报价也不能虚高，做好是能在有限的经费中尽量保证课题完整性。可以要求公司根据预算来调整优化方案，尽可能节约成本。一般流程：细胞接种培养-划痕-不同时间点拍照细胞迁移和侵袭实验是体外模拟细胞迁移和侵袭能力的检测方法。