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细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡

流式细胞术检测细胞周期：

细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。(4)缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面,保持二者分层界面。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

PI法是经典的周期检测方法。结果与结论:培养前4d细胞增殖不明显第5~10天迅速增殖，并可见细胞集落及线状结构形成培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能流式细胞仪检测体外培养第十天的细胞,CD133+细胞占19。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。

细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。该过程发生在之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。

一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。

结果示例：

                                   图 A 细胞周期检测图；B 细胞凋亡检测图

选择实验外包公司需要注意哪些事项？

报价

报价单一定要有明细。规范的外包公司会根据实验方案里的各项内容进行核算报价，材料是多少、人工检测是多少，可以看到每一笔钱花在哪里，避免笼统的报价。电镜下凋亡细胞表现为染色质凝集、核浓缩、核裂解、胞浆收缩和胞膜具有发泡现象及凋亡小体出现等。另外注意不要一味地追求，做过实验的都知道实验成本，外包还需要考虑人工成本。如果价格过低，实验数据就难以保证可靠和来源了。当然报价也不能虚高，做好是能在有限的经费中尽量保证课题完整性。可以要求公司根据预算来调整优化方案，尽可能节约成本。

关于细胞冻存的注意事项：

1.  为保持细胞大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。

2.  冻存物距液氮面越近温度越低。透射电镜观察自噬小体方法利用光学显微镜，借助相应的染色方法，可以观察细胞凋亡时会出现的一系列形态特征。标准的低冻速度为－1℃~12℃/ 分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/ 分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。

3.  初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。