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自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，终将吞食物在溶酶体内降解的过程,自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构,内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、

病毒和***等。单丹磺酰尸胺(Dansylcad***erine,MDC是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被于检测自噬体形成的特异性标记染色剂,其检测激发滤光片波长355nm ,阻断滤光片波长512nm。Leagene MDC染色液适用于培养细胞的自噬染色，可与EB合用双染。7、将6孔板放入培养箱中继续培养6小时后吸出培养基换上新配置的培养基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(***1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(***2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。细胞实验部分设备图片公司目前拥有多项专利产品及技术，其中发明专利两项，软件著作权八项，实用新型专利三项，商标两件。( autophagic vacuolo *** )

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring) 自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。这是由于zhongt瘤细胞自身可分泌多种生长因子，诱导血管生成。

3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。)

4、MDC (Monodansylcad***erine ，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

细胞培养中常见的污染及解决方法

支原体污染

支原体是隐蔽的污染物，不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象，比如细胞病变和浊度或 pH 值变化（即使在严重污染的培养基中），这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛中，支原体是常见的微生物之一。

解决方法：通常的过滤灭菌方法对支原体没有影响。细胞一旦被支原体污染，特别是对重要的细胞系，必须去除支原体，一般的方法有、抗和抗与补体联合。值得注意的是，支原体很突出的结构特征是没有细胞壁。因此，它对作用于细胞壁的生物合成（如 β-内酰胺类、万古等）完全不敏感，并且通常对多粘菌素、利福平和类具有耐药性。相反，四环素类和大环内酯类对支原体的***作用很强，而氨基糖苷类和氯的***作用较弱。小鼠精原gan细胞分离富集和培养成年小鼠gao丸中约有108个细胞,其中约有2×104个是精原gan细胞,仅占gao丸生精上皮细胞总数的0。

1、操作步骤 [方法一]：

(1) 细胞培养：取 6 孔培养板 (或用 35 mm 培养皿)，向每孔中加入 2 mL 含 1～2×105 个细胞培养液，37℃ CO2 培养至 40%～60% 汇合时 (汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量)A 液：用不含培养基稀释 1-10 μg DNA，终量 100μL，B 液：用不含培养基稀释 2-50 μgLR，终量 100μL，轻轻混合 A、B 液，室温中置 10-15 分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 LR 或 DNA 浓度过高所致，应酌情减量)。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。

(3) 转染准备：用 2 mL 不含培养液漂洗两次，再加入 1 mL 不含培养液。

(4) 转染：把 A/B 复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃ 温箱置 6～24 小时，吸除无转染液，换入正常培养液继续培养。

(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加，对转染效率有很大影响。