宿迁细胞实验外包公司询价咨询「英瀚斯」

公司目前拥有多项产品及技术，其中发明两项，软件著作权八项，实用新型三项，商标两件。电镜下凋亡细胞表现为染色质凝集、核浓缩、核裂解、胞浆收缩和胞膜具有发泡现象及凋亡小体出现等。公司先后获得“江苏省民营科技企业”、“江苏省科技型中小企业”、“江苏省专精特新中小企业”等荣誉资质，连续多年被评为“东南大学***大学科技园企业”。2019年公司成为江苏省生物技术协会第七届理事会的特邀理事，成立了“李冬冬创新工作室”，并获得了南京市“工人先锋号”的荣誉称号。

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。相较于直接对进行基于蛋白质分析的测序相比，得益于***测序技术的发展，杂交瘤测序可以提供更准确更可靠的结果，防止蛋白测序中如亮氨酸/异亮氨酸较难区分等潜在风险。自噬体(***1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(***2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo *** )

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring) 自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。(4)缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面,保持二者分层界面。无自噬时，GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。去除髓质后将皮质剪成约1-2mm'的碎块，轻碾shen皮质依次通过80。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、MDC (Monodansylcad***erine ，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

细胞培养中常见的污染及解决方法

***污染

***污染后，培养基一般清澈，保持原色。细丝可以在显微镜下观察到。在光学显微镜下可以观察到核固缩、质浓缩和凋亡小体等典型的凋亡现象。，一些***类似于死细胞碎片，但其中许多清晰可见，看起来像珊瑚，比较容易区分。此外，它们会慢慢长出细细的黑色细丝，因为它们生长得比较慢，不像***那样容易被发现，一旦发现培养基被污染，它们将很难存活。

解决方法：一旦被***污染，果断丢弃，然后对细胞房、CO2 培养箱、器皿和培养基进行消毒。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 细胞/孔接种 6 孔板 (或 35 mm 培养皿) 培养 24 小时，使其达到 50～60% 板底面积。

(2) 在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下：

①在 1 mL 无 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。

②旋转 1 秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

③室温下放置 5～10 分钟，使 DNA 结合在脂质体上。

(3) 弃去细胞中的旧液，用 1 mL 无 DMEM 洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂质体复合物，37℃ 培养 3～5 小时。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，继续培养 14～24 小时，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM，2 mL/孔，再培养 24～48 小时。

(6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下：

(1) 接种细胞同前，细胞长至 50% 板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2)、(3) 步骤。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM，37℃ 培养 48 小时。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染，方法参照细胞筛选法进行。